Repositorio
Institucional

Salamone, Daniel Felipe

Gabriela Canel, Natalia

Suva, Mariana

Jimena Bevacqua, Romina

Elena Arias, Maria

Felmer, Ricardo

Improved embryo development using high cysteamine concentration during IVM and sperm co-culture with COCs previous to ICSI in bovine

ELSEVIER SCIENCE INC

THERIOGENOLOGY

en

In contrast to other species, intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in bovine remains inefficient, resulting in low embryo developmental rates. It is unclear whether such inefficiency is due to the poor response of bovine ooplasms to the injection stimulus, or to the inability of bull sperm to induce oocyte activation. In order to facilitate these events, two strategies were assessed: the use of high concentration of cysteamine [Cys] during IVM, and the selection of sperm attached to cumulus cells after incubation with COCs for ICSI. First, COCs were IVM with increasing [Cys] and subjected to IVF. Zygotes from all groups were cultured under different O-2 tensions and development to blastocyst was evaluated. In a second experiment, sperm were co-cultured for 3 h with COCs and acrosome reaction was studied. Afterwards, the best IVM and IVC conditions determined on Experiment I were used for ICSI assay. COCs were matured for 21 h with I (Cys 1) or 0.1 mM Cys (Cys 0.1 groups, standard condition). In addition, COCs were incubated for >= 3 h with 16 x 10(6) spermiml and only sperm attached to cumulus cells were selected for ICSI (ICSI + Co-cult groups). After chemical activation, embryos were cultured in SOF medium under low O-2 tension. Cleavage and blastocyst rates were evaluated at days 2 and 7 of IVC, respectively. Finally, the relative expression of eight genes indicators of embryo quality was compared between ICSI and IVF control blastocysts by qPCR. Cleavage rates were higher for Cys 0.1 ICSI + Co-cult and Cys 1 ICSI + Co-cult groups (n = 117, 92% and n = 116, 79%, respectively) compared to their controls (n = 132, 60% for Cys 0.1 ICSI and n = 108, 52% for Cys 1 ICSI) (p <= 0.05). Interestingly, the combined treatment (Cys 1 ICSI + Co-cult) showed higher blastocyst rates than all other ICSI groups (23 vs. 11, 18 and 14% for Cys 0.1 ICSI + Co-cult, Cys 1 ICSI, and Cys 0.1 ICSI, respectively) (p <= 0.05). Moreover, incubation with COCs increased the rates of live acrosome reacted sperm (p <= 0.05). The relative abundance of mRNA5 coding for INFr, CAT, DNMTI, OCT4, and HDAC3 did not differ between treatments (p <= 0.05). SOD2, HADC1 and HADC2 expression was higher for Cys 0.1 ICSI than for IVF embryos (p <= 0.05). Group Cys1 ICSI did not differ from IVF for those three genes, neither did Cys 1 ICSI + Co-cult, except for HDACI (p <= 0.05). In conclusion, the use of 1 mM Cys during IVM and of sperm incubated with mature COCs might be a good strategy to improve ICSI outcomes in cattle. (C) 2018 Published by Elsevier Inc.

A diferencia de otras especies, la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) en bovinos sigue siendo ineficiente, lo que resulta en bajas tasas de desarrollo embrionario. No está claro si dicha ineficiencia se debe a la pobre respuesta de los ooplasmas bovinos al estímulo de la inyección, o a la incapacidad del esperma de toro para inducir la activación de los ovocitos. Con el fin de facilitar estos eventos, se evaluaron dos estrategias: el uso de alta concentración de cisteamina [Cys] durante la IVM, y la selección de espermatozoides unidos a células del cúmulo después de la incubación con COC para ICSI. Primero, los COC fueron IVM con aumento de [Cys] y sometidos a FIV. Los cigotos de todos los grupos se cultivaron bajo diferentes tensiones de O-2 y se evaluó el desarrollo a blastocisto. En un segundo experimento, los espermatozoides se co-cultivaron durante 3 h con COC y se estudió la reacción acrosómica. Posteriormente, las mejores condiciones de IVM y IVC determinadas en el Experimento I se utilizaron para el ensayo de ICSI. Los COC se maduraron durante 21 h con I (Cys 1) o 0,1 mM de Cys (grupos Cys 0,1, condición estándar). Además, los COC se incubaron durante ≥ 3 h con 16 x 10(6) espermatozoides y solo se seleccionaron los espermatozoides unidos a las células del cúmulo para ICSI (grupos ICSI + Co-cultivo). Tras la activación química, los embriones se cultivaron en medio SOF a baja tensión de O₂. Se evaluaron las tasas de segmentación y blastocisto a los 2 y 7 días de la VCI, respectivamente. Finalmente, se comparó la expresión relativa de ocho genes indicadores de la calidad embrionaria entre blastocistos ICSI y control de FIV mediante qPCR. Las tasas de clivaje fueron mayores para los grupos Cys 0.1 ICSI + Co-cultivo y Cys 1 ICSI + Co-cultivo (n = 117, 92% y n = 116, 79%, respectivamente) en comparación con sus controles (n = 132, 60% para Cys 0.1 ICSI y n = 108, 52% para Cys 1 ICSI) (p <= 0,05). Curiosamente, el tratamiento combinado (Cys 1 ICSI + Co-cultivo) mostró tasas de blastocisto más altas que todos los demás grupos ICSI (23 frente a 11, 18 y 14% para Cys 0.1 ICSI + Co-cultivo, Cys 1 ICSI y Cys 0.1 ICSI, respectivamente) (p <= 0,05). Además, la incubación con COC aumentó las tasas de espermatozoides vivos con reacción acrosómica (p <= 0,05). La abundancia relativa del ARNm5 que codifica INFr, CAT, DNMTI, OCT4 y HDAC3 no difirió entre tratamientos (p <= 0,05). La expresión de SOD2, HADC1 y HADC2 fue mayor para los embriones sometidos a ICSI con Cys 0.1 que para los de FIV (p <= 0,05). El grupo ICSI con Cys1 no difirió de la FIV para estos tres genes, ni tampoco el grupo ICSI con Cys 1 + cocultivo, excepto para HDACI (p <= 0,05). En conclusión, el uso de 1 mM de Cys durante la IVM y de espermatozoides incubados con COC maduros podría ser una buena estrategia para mejorar los resultados de la ICSI en el ganado. (C) 2018 Publicado por Elsevier Inc.

Artículo original

Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica PICT-2010-2716 del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Argentina.

This work was supported by the grant from Agencia Nacional de Promocion Cientifica y Tecnologica PICT-2010-2716 from the Ministry of Science and Technology of Argentina.

10.1016/j.theriogenology.2018.05.017

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Sperm injection

Cumulus cells

Pretreatment

In vitro maturation

Oxygen tension

Gene expression

Inyección de esperma

Células de cúmulo

Pretratamiento

Maduración in vitro

Tensión de oxígeno

expresión genética

Reproductive Biology# Veterinary Sciences

Sperm injection

Cumulus cells

Pretreatment

In vitro maturation

Oxygen tension

Gene expression

Inyección de esperma

Células de cúmulo

Pretratamiento

Maduración in vitro

Tensión de oxígeno

expresión genética

Ciencia Animal y lechería

Biología Reproductiva

Biotecnología agrícola

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WOS:000436055900004

Improved embryo development using high cysteamine concentration during IVM and sperm co-culture with COCs previous to ICSI in bovine

hdl.handle.net/11336/91372

Artículo original

ELSEVIER SCIENCE INC

THERIOGENOLOGY

Biología Reproductiva

Ciencias Veterinarias

0093-691X

en

ANICyT Argentina PICT-2010-2716

This work was supported by the grant from Agencia Nacional de Promocion Cientifica y Tecnologica PICT-2010-2716 from the Ministry of Science and Technology of Argentina.

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ANICyT Argentina PICT-2010-2716